深入解析分析方法驗(yàn)證的關(guān)鍵要素與實(shí)操要點(diǎn)！
在藥品研發(fā)、生產(chǎn)與質(zhì)量控制領(lǐng)域，分析方法驗(yàn)證是確保藥品質(zhì)量可靠、檢測結(jié)果準(zhǔn)確的核心環(huán)節(jié)。下面恒譜生將詳細(xì)探討分析方法驗(yàn)證的定義、法規(guī)要求、應(yīng)用場景、驗(yàn)證流程、關(guān)鍵驗(yàn)證指標(biāo)、具體內(nèi)容以及如何制定合理的可接受標(biāo)準(zhǔn)，幫助朋友們?nèi)嬲莆者@一重要概念與實(shí)操要點(diǎn)。
一、分析方法驗(yàn)證的定義與重要性
分析方法驗(yàn)證是指通過一系列科學(xué)實(shí)驗(yàn)與評(píng)估，證明所建立的分析方法能夠滿足特定檢測要求的過程。其目的是確保分析方法在實(shí)際應(yīng)用中能夠準(zhǔn)確、可靠地測定藥品的質(zhì)量屬性，如含量、雜質(zhì)、溶出度等。在藥品研發(fā)過程中，分析方法驗(yàn)證是確定藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵步驟;在生產(chǎn)過程中，它為藥品的放行提供了科學(xué)依據(jù);在變更管理中，驗(yàn)證則確保變更后的分析方法依然有效。
二、分析方法驗(yàn)證的法規(guī)要求
分析方法驗(yàn)證受到嚴(yán)格的法規(guī)監(jiān)管。中國GMP(藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范)明確規(guī)定，檢驗(yàn)方法必須經(jīng)過驗(yàn)證或確認(rèn)。具體條款如下：
第十二條：質(zhì)量控制的基本要求中指出，檢驗(yàn)方法應(yīng)當(dāng)經(jīng)過驗(yàn)證或確認(rèn)。
第一百四十二條：當(dāng)影響產(chǎn)品質(zhì)量的主要因素(如原輔料、包裝材料、生產(chǎn)設(shè)備、生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)工藝、檢驗(yàn)方法等)發(fā)生變更時(shí)，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行確認(rèn)或驗(yàn)證。
第二百二十三條：物料和不同生產(chǎn)階段產(chǎn)品的檢驗(yàn)應(yīng)當(dāng)至少符合以下要求：
企業(yè)應(yīng)當(dāng)確保藥品按照注冊批準(zhǔn)的方法進(jìn)行全項(xiàng)檢驗(yàn)。
符合下列情形之一的，應(yīng)當(dāng)對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證：
采用新的檢驗(yàn)方法;
檢驗(yàn)方法需變更的;
采用《中華人民共和國藥典》及其他法定標(biāo)準(zhǔn)未收載的檢驗(yàn)方法;
法規(guī)規(guī)定的其他需要驗(yàn)證的檢驗(yàn)方法。
對(duì)不需要進(jìn)行驗(yàn)證的檢驗(yàn)方法，企業(yè)應(yīng)當(dāng)對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行確認(rèn)，以確保檢驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠。
第二百三十條：產(chǎn)品的放行應(yīng)當(dāng)至少符合以下要求：
在批準(zhǔn)放行前，應(yīng)當(dāng)對(duì)每批藥品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，保證藥品及其生產(chǎn)符合注冊和本規(guī)范要求，并確認(rèn)主要生產(chǎn)工藝和檢驗(yàn)方法經(jīng)過驗(yàn)證。
這些法規(guī)條款為分析方法驗(yàn)證提供了明確的法律依據(jù)和操作框架，確保藥品質(zhì)量控制的科學(xué)性和規(guī)范性。
三、什么時(shí)候需要進(jìn)行分析方法驗(yàn)證
分析方法驗(yàn)證并非在所有情況下都需要進(jìn)行，而是根據(jù)具體的應(yīng)用場景和法規(guī)要求來決定。以下是一些常見的需要進(jìn)行分析方法驗(yàn)證的情況：
（一）建立藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)：在藥品研發(fā)階段，當(dāng)確定藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，需要對(duì)用于檢測藥品質(zhì)量的分析方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確保這些方法能夠準(zhǔn)確、可靠地測定藥品的質(zhì)量屬性。
（二）變更藥品生產(chǎn)工藝或制劑組分時(shí)：如果藥品的生產(chǎn)工藝或制劑組分發(fā)生了變更，可能會(huì)對(duì)藥品的質(zhì)量產(chǎn)生影響，因此需要重新驗(yàn)證分析方法，以確保變更后的分析方法依然能夠準(zhǔn)確地檢測藥品的質(zhì)量。
（三）修訂原分析方法時(shí)：當(dāng)對(duì)原有的分析方法進(jìn)行修訂或改進(jìn)時(shí)，需要對(duì)修訂后的分析方法進(jìn)行驗(yàn)證，以證明其有效性和可靠性。
（四）采用新的檢驗(yàn)方法時(shí)：如果企業(yè)采用了一種新的檢驗(yàn)方法，需要對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確保其能夠滿足藥品質(zhì)量控制的要求。
（五）法規(guī)要求時(shí)：在某些情況下，法規(guī)可能會(huì)要求對(duì)特定的檢驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確保藥品的質(zhì)量符合規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。
四、分析方法驗(yàn)證的流程
分析方法驗(yàn)證的流程是一個(gè)系統(tǒng)化的過程，主要包括以下幾個(gè)步驟：
驗(yàn)證方案的制定：在驗(yàn)證開始之前，需要制定詳細(xì)的驗(yàn)證方案。驗(yàn)證方案應(yīng)包括驗(yàn)證的目的、范圍、驗(yàn)證指標(biāo)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣品準(zhǔn)備、數(shù)據(jù)處理和可接受標(biāo)準(zhǔn)等內(nèi)容。驗(yàn)證方案的制定應(yīng)基于對(duì)藥品特性和分析方法的深入了解，確保驗(yàn)證過程的科學(xué)性和合理性。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品準(zhǔn)備：根據(jù)驗(yàn)證方案，設(shè)計(jì)具體的實(shí)驗(yàn)步驟和樣品制備方法。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)考慮各種可能影響分析結(jié)果的因素，如樣品的濃度范圍、實(shí)驗(yàn)條件的變化等。樣品的準(zhǔn)備應(yīng)確保樣品的代表性和均勻性，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
實(shí)驗(yàn)操作與數(shù)據(jù)記錄：按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，并詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)過程中的各種數(shù)據(jù)和觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)，確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和可靠性。數(shù)據(jù)記錄應(yīng)準(zhǔn)確、完整，以便于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和評(píng)估。
數(shù)據(jù)分析與評(píng)估：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，評(píng)估分析方法的各項(xiàng)驗(yàn)證指標(biāo)是否符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)分析應(yīng)采用科學(xué)的統(tǒng)計(jì)方法，如計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相關(guān)系數(shù)等，以客觀地評(píng)價(jià)分析方法的性能。評(píng)估結(jié)果應(yīng)詳細(xì)記錄在驗(yàn)證報(bào)告中，為最終的驗(yàn)證結(jié)論提供依據(jù)。
驗(yàn)證報(bào)告的撰寫：驗(yàn)證報(bào)告是對(duì)整個(gè)驗(yàn)證過程和結(jié)果的總結(jié)，應(yīng)包括驗(yàn)證方案、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)分析和評(píng)估等內(nèi)容。驗(yàn)證報(bào)告應(yīng)詳細(xì)、清晰，能夠全面反映驗(yàn)證過程的科學(xué)性和驗(yàn)證結(jié)果的有效性。驗(yàn)證報(bào)告應(yīng)經(jīng)過審核和批準(zhǔn)，作為分析方法驗(yàn)證的最終文件記錄。
五、驗(yàn)證的分析項(xiàng)目和驗(yàn)證指標(biāo)
在分析方法驗(yàn)證中，需要對(duì)多個(gè)分析項(xiàng)目和驗(yàn)證指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，以全面評(píng)價(jià)分析方法的性能。以下是一些常見的分析項(xiàng)目和驗(yàn)證指標(biāo)：
(一)分析項(xiàng)目
含量測定：用于測定藥品中有效成分的含量，是藥品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一。含量測定方法的驗(yàn)證應(yīng)確保其能夠準(zhǔn)確、可靠地測定藥品的含量，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。
雜質(zhì)檢查：用于檢測藥品中雜質(zhì)的種類和含量，包括有機(jī)雜質(zhì)、無機(jī)雜質(zhì)和殘留溶劑等。雜質(zhì)檢查方法的驗(yàn)證應(yīng)確保其能夠靈敏、專一地檢測出藥品中的雜質(zhì)，為藥品的安全性提供保障。
溶出度測定：對(duì)于固體制劑，溶出度測定是評(píng)估藥品在體外釋放藥物的能力的重要指標(biāo)。溶出度測定方法的驗(yàn)證應(yīng)確保其能夠模擬體內(nèi)藥物釋放的過程，為藥品的療效提供參考。
鑒別反應(yīng)：用于確認(rèn)藥品的真?zhèn)危ㄟ^特定的化學(xué)反應(yīng)或物理性質(zhì)來區(qū)分藥品與其他物質(zhì)。鑒別反應(yīng)方法的驗(yàn)證應(yīng)確保其具有良好的專屬性和靈敏度，能夠準(zhǔn)確地鑒別藥品。
其他相關(guān)項(xiàng)目：根據(jù)藥品的特性和質(zhì)量控制的要求，還可能需要對(duì)其他相關(guān)項(xiàng)目進(jìn)行驗(yàn)證，如pH值測定、水分含量測定、粒度分布測定等。
(二)驗(yàn)證指標(biāo)
專屬性：指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在的情況下，分析方法能夠準(zhǔn)確測定出被測物的能力。專屬性是分析方法驗(yàn)證的重要指標(biāo)之一，對(duì)于含量測定、雜質(zhì)檢查和鑒別反應(yīng)等分析項(xiàng)目尤為重要。驗(yàn)證專屬性時(shí)，應(yīng)考察分析方法在不同條件下的分離能力和干擾情況，確保分析方法能夠準(zhǔn)確地測定目標(biāo)成分。
準(zhǔn)確度：指用所建立的分析方法測定的結(jié)果與真實(shí)值或參比值接近的程度，通常用回收率(%)表示。準(zhǔn)確度的驗(yàn)證應(yīng)在規(guī)定的線性范圍內(nèi)進(jìn)行，通過與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌愤M(jìn)行比較，評(píng)估分析方法的準(zhǔn)確性。準(zhǔn)確度的驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法能夠提供可靠的檢測結(jié)果。
精密度：指在規(guī)定的測定條件下，同一份均勻供試品經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。精密度的驗(yàn)證包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性三個(gè)方面。重復(fù)性是指在短時(shí)間內(nèi)由同一個(gè)分析人員對(duì)同一份樣品進(jìn)行多次測定的精密度;中間精密度是指在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的條件改變(如不同時(shí)間、不同分析人員、不同設(shè)備等)時(shí)測定結(jié)果的精密度;重現(xiàn)性是指不同實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果的精密度。精密度的驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法的可靠性和可重復(fù)性。
檢測限：指試樣中被測物能被檢測出的最低量。檢測限是雜質(zhì)檢查和限度試驗(yàn)的重要指標(biāo)，用于確定分析方法能夠檢測到的最低濃度或含量。檢測限的驗(yàn)證通常采用直觀法、信噪比法或基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法等方法進(jìn)行。驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法能夠靈敏地檢測出藥品中的雜質(zhì)或微量成分。
定量限：指試樣中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求。定量限的驗(yàn)證方法與檢測限類似，但要求更高，需要同時(shí)滿足準(zhǔn)確度和精密度的要求。定量限的驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法能夠準(zhǔn)確地定量測定藥品中的微量成分。
線性：指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，線性試驗(yàn)結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈比例關(guān)系的能力。線性是含量測定和雜質(zhì)檢查等分析項(xiàng)目的重要指標(biāo)，用于評(píng)估分析方法在不同濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系。線性的驗(yàn)證應(yīng)在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)進(jìn)行，通過制備一系列不同濃度的對(duì)照品溶液，測定其響應(yīng)信號(hào)，并用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。線性驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法在規(guī)定的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
范圍：指分析方法能達(dá)到精密度、準(zhǔn)確度和線性要求時(shí)的高低限濃度或量的區(qū)間。范圍的驗(yàn)證應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用及其線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。例如，原料藥和制劑含量測定的范圍一般為測定濃度的80%～120%;制劑含量均勻度檢查的范圍一般為測定濃度的70%～130%;雜質(zhì)測定的范圍應(yīng)根據(jù)初步實(shí)際測定數(shù)據(jù)，擬訂為規(guī)定限度的±20%。范圍的驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法在規(guī)定的范圍內(nèi)能夠準(zhǔn)確、可靠地測定藥品的質(zhì)量屬性。
耐用性：指在測定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測定結(jié)果不受影響的承受程度。耐用性是分析方法驗(yàn)證的重要指標(biāo)之一，用于評(píng)估分析方法在實(shí)際應(yīng)用中的穩(wěn)定性和可靠性。耐用性的驗(yàn)證應(yīng)考慮各種可能影響分析結(jié)果的因素，如被測溶液的穩(wěn)定性、樣品的提取次數(shù)、時(shí)間、流動(dòng)相的組成和pH值、不同品牌或不同批號(hào)的同類型色譜柱、柱溫、流速等。通過在這些條件發(fā)生小的變動(dòng)時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，評(píng)估分析方法的耐用性。耐用性驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法在常規(guī)檢驗(yàn)中能夠穩(wěn)定地提供可靠的檢測結(jié)果。
六、分析方法驗(yàn)證的具體內(nèi)容
(一)專屬性
專屬性是分析方法驗(yàn)證的重要內(nèi)容之一，它確保在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在的情況下，分析方法能夠準(zhǔn)確測定出被測物。以下是專屬性驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
鑒別反應(yīng)：鑒別反應(yīng)應(yīng)能夠區(qū)分可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似的化合物。在驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)使用不含被測成分的供試品以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確保這些物質(zhì)在鑒別反應(yīng)中均呈陰性反應(yīng)，而被測成分則呈陽性反應(yīng)。
含量測定和雜質(zhì)測定：對(duì)于含量測定和雜質(zhì)測定，采用的色譜法和其他分離方法應(yīng)附代表性圖譜，以說明方法的專屬性，并應(yīng)標(biāo)明諸成分在圖中的位置。色譜法中的分離度應(yīng)符合要求。在雜質(zhì)對(duì)照品可獲得的情況下，對(duì)于含量測定，試樣中可加入雜質(zhì)或輔料，考察測定結(jié)果是否受干擾，并可與未加雜質(zhì)或輔料的試樣比較測定結(jié)果。對(duì)于雜質(zhì)檢查，也可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考察雜質(zhì)之間能否得到分離。在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣進(jìn)行測定，與另一個(gè)經(jīng)驗(yàn)證的方法或藥典方法比較結(jié)果。也可用強(qiáng)光照射、高溫、高濕、酸(堿)水解或氧化的方法進(jìn)行強(qiáng)制破壞，以研究可能的降解產(chǎn)物和降解途徑對(duì)含量測定和雜質(zhì)測定的影響。含量測定方法應(yīng)比對(duì)兩種方法的結(jié)果，雜質(zhì)檢査應(yīng)比對(duì)檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)，必要時(shí)可采用光電二極管陣列檢測和質(zhì)譜檢測，進(jìn)行峰純度檢查。
(二)準(zhǔn)確度
準(zhǔn)確度是評(píng)估分析方法測定結(jié)果與真實(shí)值或參比值接近程度的重要指標(biāo)，通常用回收率(%)表示。以下是準(zhǔn)確度驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
化學(xué)藥含量測定方法的準(zhǔn)確度：原料藥可用已知純度的對(duì)照品或供試品進(jìn)行測定，或用所測定結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一個(gè)方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較。制劑可在處方量空白輔料中，加入已知量被測物對(duì)照品進(jìn)行測定。如不能得到制劑輔料的全部組分，可向待測制劑中加入已知量的被測物進(jìn)行測定，或用所建立方法的測定結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一個(gè)方法測定結(jié)果進(jìn)行比較。
化學(xué)藥雜質(zhì)定量測定的準(zhǔn)確度：可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行測定。如不能得到雜質(zhì)對(duì)照品，可用所建立的方法與另一成熟方法(如藥典標(biāo)準(zhǔn)方法或經(jīng)過驗(yàn)證的方法)的測定結(jié)果進(jìn)行比較。
中藥化學(xué)成分測定方法的準(zhǔn)確度：可用已知純度的對(duì)照品進(jìn)行加樣回收率測定，即向已知被測成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的被測成分對(duì)照品，依法測定。用實(shí)測值與供試品中含有量之差，除以加入對(duì)照品量計(jì)算回收率。在加樣回收試驗(yàn)中須注意對(duì)照品的加入量與供試品中被測成分含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi);加入的對(duì)照品的量要適當(dāng)，過小則引起較大的相對(duì)誤差，過大則干擾成分相對(duì)減少，真實(shí)性差。
數(shù)據(jù)要求：對(duì)于化學(xué)藥應(yīng)報(bào)告已知加入量的回收率(%)，或測定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間(置信度一般為95%);對(duì)于中藥應(yīng)報(bào)告供試品取樣量、供試品中含有量、對(duì)照品加入量、測定結(jié)果和回收率(%)計(jì)算值，以及回收率(%)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)或置信區(qū)間。樣品中待測定成分含量和回收率限度關(guān)系可參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和指南。
(三)精密度
精密度是評(píng)估分析方法在規(guī)定條件下測定結(jié)果重復(fù)性和重現(xiàn)性的關(guān)鍵指標(biāo)，通常用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。以下是精密度驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
重復(fù)性：在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度(分析方法擬定的樣品測定濃度，相當(dāng)于100%濃度水平)的供試品，用至少6份的測定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià);或設(shè)計(jì)至少3種不同濃度，每種濃度分別制備至少3份供試品溶液進(jìn)行測定，用至少9份樣品的測定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用至少9份測定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，濃度的設(shè)定應(yīng)考慮樣品的濃度范圍。
中間精密度：考察隨機(jī)變動(dòng)因素，如不同日期、不同分析人員、不同儀器對(duì)精密度的影響，應(yīng)進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)。
重現(xiàn)性：國家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用的分析方法，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)，如通過不同實(shí)驗(yàn)室協(xié)同檢驗(yàn)獲得重現(xiàn)性結(jié)果。協(xié)同檢驗(yàn)的目的、過程和重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中。應(yīng)注意重現(xiàn)性試驗(yàn)所用樣品質(zhì)量的一致性及貯存運(yùn)輸中的環(huán)境對(duì)該一致性的影響，以免影響重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果。
數(shù)據(jù)要求：均應(yīng)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間。樣品中待測定成分含量和精密度RSD可接受范圍參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和指南。在基質(zhì)復(fù)雜、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，精密度限度可適當(dāng)放寬。
(四)檢測限
檢測限是評(píng)估分析方法能夠檢測出的最低量的重要指標(biāo)，它僅作為限度試驗(yàn)指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù)，沒有定量意義。以下是檢測限驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
直觀法：用已知濃度的被測物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。
信噪比法：用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號(hào)與空白樣品測出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地檢測出的被測物質(zhì)最低濃度或量。一般以信噪比為3∶1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測限。
基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法：按照LOD=3.3δ/S公式計(jì)算。式中LOD：檢測限;δ：響應(yīng)值的偏差;S：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。δ可以通過下列方法測得：測定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差;標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
數(shù)據(jù)要求：上述計(jì)算方法獲得的檢測限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)附測定圖譜，說明試驗(yàn)過程和檢測限結(jié)果。
(五)定量限
定量限是評(píng)估分析方法能夠定量測定的最低量的重要指標(biāo)，其測定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求。以下是定量限驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
直觀法：用已知濃度的被測物，試驗(yàn)出能被可靠地定量測定的最低濃度或量。
信噪比法：用于能顯示基線噪聲的分析方法，即將已知低濃度試樣測出的信號(hào)與空白樣品測出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地定量的被測物質(zhì)的最低濃度或量。一般以信噪比為10∶1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定定量限。
基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法：按照LOQ=10δ/S公式計(jì)算。式中LOQ：定量限;δ：響應(yīng)值的偏差;S：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。δ可以通過下列方法測得：測定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差;采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
數(shù)據(jù)要求：上述計(jì)算方法獲得的定量限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)附測試圖譜，說明測試過程和定量限結(jié)果，包括準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證數(shù)據(jù)。
(六)線性
線性是評(píng)估分析方法在設(shè)計(jì)范圍內(nèi)線性關(guān)系的重要指標(biāo)，它確保在不同濃度下測定結(jié)果與被測物濃度呈比例關(guān)系。以下是線性驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
線性試驗(yàn)設(shè)計(jì)：應(yīng)在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)測定線性關(guān)系。可用同一對(duì)照品貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱取對(duì)照品，制備一系列對(duì)照品溶液的方法進(jìn)行測定，至少制備5個(gè)不同濃度水平。以測得的響應(yīng)信號(hào)作為被測物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。必要時(shí)，響應(yīng)信號(hào)可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算，或者可采用描述濃度-響應(yīng)關(guān)系的非線性模型。
數(shù)據(jù)要求：應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)、殘差平方和、線性圖(或其他數(shù)學(xué)模型)。線性驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法在規(guī)定的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
(七)范圍
范圍是評(píng)估分析方法在精密度、準(zhǔn)確度和線性要求下能夠測定的高低限濃度或量的區(qū)間。以下是范圍驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
范圍確定：范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用及其線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。例如，原料藥和制劑含量測定的范圍一般為測定濃度的80%～120%;制劑含量均勻度檢查的范圍一般為測定濃度的70%～130%;溶出度或釋放度中的溶出量測定的范圍一般為限度的±30%，如規(guī)定了限度范圍，則應(yīng)為下限的-20%至上限的+20%;雜質(zhì)測定的范圍應(yīng)根據(jù)初步實(shí)際測定數(shù)據(jù)，擬訂為規(guī)定限度的±20%。如果一個(gè)試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行含量測定和純度檢查，且僅使用100%的對(duì)照品，線性范圍應(yīng)覆蓋雜質(zhì)的報(bào)告水平至規(guī)定含量的120%。在中藥分析中，范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果及要求確定。對(duì)于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其驗(yàn)證范圍應(yīng)大于被限定含量的區(qū)間。
數(shù)據(jù)要求：范圍驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法在規(guī)定的范圍內(nèi)能夠準(zhǔn)確、可靠地測定藥品的質(zhì)量屬性。
(八)耐用性
耐用性是評(píng)估分析方法在測定條件有小的變動(dòng)時(shí)測定結(jié)果不受影響的承受程度的重要指標(biāo)。以下是耐用性驗(yàn)證的具體內(nèi)容：
耐用性評(píng)估：耐用性驗(yàn)證應(yīng)考慮各種可能影響分析結(jié)果的因素，如被測溶液的穩(wěn)定性、樣品的提取次數(shù)、時(shí)間、流動(dòng)相的組成和pH值、不同品牌或不同批號(hào)的同類型色譜柱、柱溫、流速等。通過在這些條件發(fā)生小的變動(dòng)時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，評(píng)估分析方法的耐用性。
數(shù)據(jù)要求：耐用性驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保分析方法在常規(guī)檢驗(yàn)中能夠穩(wěn)定地提供可靠的檢測結(jié)果。
七、如何制定方法驗(yàn)證的可接受標(biāo)準(zhǔn)
制定方法驗(yàn)證的可接受標(biāo)準(zhǔn)是分析方法驗(yàn)證的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，它為驗(yàn)證結(jié)果的評(píng)估提供了明確的依據(jù)。以下是制定可接受標(biāo)準(zhǔn)的具體方法：
參考藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確定各項(xiàng)指標(biāo)的可接受范圍。藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是藥品生產(chǎn)和質(zhì)量控制的基本依據(jù)，因此在制定可接受標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)首先參考藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的要求。
結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)長期穩(wěn)定性試驗(yàn)、加速穩(wěn)定性試驗(yàn)和影響因素試驗(yàn)的結(jié)果，評(píng)估藥品在不同條件下的穩(wěn)定性變化規(guī)律，確定合理的可接受標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)能夠反映分析方法在實(shí)際應(yīng)用中的性能，因此在制定可接受標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)充分考慮試驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和合理性。
考慮藥品用途和風(fēng)險(xiǎn)：對(duì)于一些高風(fēng)險(xiǎn)藥品或特殊用途藥品，可接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)更為嚴(yán)格。藥品的用途和風(fēng)險(xiǎn)不同，對(duì)藥品質(zhì)量的要求也不同。因此，在制定可接受標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)藥品的用途和風(fēng)險(xiǎn)，制定相應(yīng)的可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保藥品的安全性和有效性。
參考國內(nèi)外相關(guān)法規(guī)和指南：參考中國GMP、ICH等法規(guī)和指南中對(duì)藥品穩(wěn)定性研究的要求，制定符合規(guī)定的可接受標(biāo)準(zhǔn)。法規(guī)和指南為藥品生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供了明確的指導(dǎo)，因此在制定可接受標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)參考相關(guān)的法規(guī)和指南，確保可接受標(biāo)準(zhǔn)的合法性和科學(xué)性。
八、案例分析
為了更好地理解分析方法驗(yàn)證的流程和要點(diǎn)，以下是一個(gè)具體的案例分析：
案例背景
某制藥企業(yè)開發(fā)了一種新的化學(xué)藥品，需要對(duì)其含量測定方法進(jìn)行驗(yàn)證。該藥品的主要成分是化合物A，含量測定采用高效液相色譜法(HPLC)。
驗(yàn)證方案
驗(yàn)證目的：驗(yàn)證HPLC方法能否準(zhǔn)確、可靠地測定化合物A的含量。
驗(yàn)證范圍：含量測定范圍為化合物A濃度的80%～120%。
驗(yàn)證指標(biāo)：專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性、范圍和耐用性。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：采用已知純度的化合物A對(duì)照品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，制備一系列不同濃度的對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。
數(shù)據(jù)處理：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相關(guān)系數(shù)等指標(biāo)。
可接受標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)法規(guī)，制定各項(xiàng)指標(biāo)的可接受標(biāo)準(zhǔn)。
驗(yàn)證過程
專屬性驗(yàn)證：通過HPLC圖譜分析，確認(rèn)在其他成分(如雜質(zhì)、輔料等)存在的情況下，化合物A的色譜峰能夠清晰分離，無干擾。
準(zhǔn)確度驗(yàn)證：在化合物A濃度的80%、100%和120%三個(gè)水平下，分別制備3份對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。計(jì)算回收率，結(jié)果均在98%～102%之間，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。
精密度驗(yàn)證：
重復(fù)性：在同一濃度(100%)下，制備6份對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果為1.2%，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。
中間精密度：在不同日期、不同分析人員、不同儀器條件下，分別制備3份對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。計(jì)算RSD，結(jié)果為1.5%，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。
重現(xiàn)性：在不同實(shí)驗(yàn)室條件下，分別制備3份對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。計(jì)算RSD，結(jié)果為1.8%，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。
線性驗(yàn)證：制備5個(gè)不同濃度的化合物A對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制線性回歸方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)(R2)，結(jié)果為0.999.符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。
范圍驗(yàn)證：在化合物A濃度的80%～120%范圍內(nèi)，分別制備3份對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。評(píng)估線性、準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果均符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。
耐用性驗(yàn)證：在流動(dòng)相組成、pH值、柱溫等條件發(fā)生小的變動(dòng)時(shí)，分別制備3份對(duì)照品溶液，進(jìn)行HPLC分析。評(píng)估分析結(jié)果，結(jié)果均符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。
驗(yàn)證結(jié)論
通過上述驗(yàn)證過程，HPLC方法在專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性、范圍和耐用性等方面均符合可接受標(biāo)準(zhǔn)，能夠準(zhǔn)確、可靠地測定化合物A的含量。因此，該HPLC方法可用于該藥品的含量測定。
九、總結(jié)
分析方法驗(yàn)證是藥品研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)量控制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它確保分析方法能夠準(zhǔn)確、可靠地測定藥品的質(zhì)量屬性。通過了解分析方法驗(yàn)證的定義、法規(guī)要求、應(yīng)用場景、驗(yàn)證流程、關(guān)鍵驗(yàn)證指標(biāo)、具體內(nèi)容以及如何制定合理的可接受標(biāo)準(zhǔn)，可以更好地開展分析方法驗(yàn)證工作，為藥品的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。在實(shí)際操作中，應(yīng)根據(jù)藥品的特性和質(zhì)量控制要求，制定詳細(xì)的驗(yàn)證方案，嚴(yán)格進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析，確保驗(yàn)證結(jié)果的科學(xué)性和可靠性。同時(shí)，應(yīng)參考相關(guān)的法規(guī)和指南，確保驗(yàn)證工作的合法性和規(guī)范性。
發(fā)布于: 2025-08-22